Laser-Scanning-Mikroskop: Farbenspiel in der Zelle

In den Körperzellen wirken Tausende Eiweiße komplex zusammen. Wird dieses exakt aufeinander abgestimmte Zusammenspiel gestört, etwa durch einen genetischen Defekt oder Umwelteinflüsse, kann das die Entwicklung des Organismus behindern oder gar Tumore wachsen lassen.

Mediziner hoffen daher, die Entstehung solcher Erkrankungen besser begreifen – und diese wirksamer kurieren – zu können, wenn sie die Abläufe auf molekularer Ebene ergründen. Das Ziel ist nichts Geringeres als eine neue Art der Heilkunde, die bei den Ursachen ansetzt statt bei den Symptomen. „Der Weg dorthin führt über das Erkennen der Wechselwirkungen zwischen den Proteinen, die an Fehlfunktionen im Organismus beteiligt sind“, sagt Dr. Ulrich Simon, der beim Optikunternehmen Carl Zeiss Jena den Unternehmensbereich Mikroskopie leitet. Das würde eine vorbeugende Therapie ermöglichen. Ist ein Mensch bereits krank, kann die Therapie genau an den verantwortlichen Proteinen ansetzen – mit individuell auf sie und ihre Funktion zugeschnittenen Arzneistoffen.

Laser-Scanning-Mikroskope helfen, die molekularen Prozesse zu verstehen. Durch sie lassen sich Strukturen und Bewegungen in Zellen und Zellverbänden mit hoher räumlicher Präzision sichtbar machen. „In einem Laser-Scanning-Mikroskop benutzt man einen Laser, dessen Strahl auf einen winzigen Fleck fokussiert wird“, erklärt Ulrich Simon. Der Lichtfleck wird so auf die Probe projiziert, dass er nur einen einzelnen Punkt beleuchtet. Um ein Bild der ganzen Zelle aufzubauen, wird der Laserstrahl dann Punkt für Punkt über die Probe geführt.

Zellen sind, unter dem Mikroskop betrachtet, weitest gehend transparent, das heißt unsichtbar. Daher markieren Wissenschaftler Zellbestandteile und Biomoleküle in der Zelle mit Farbstoffen, die durch das Laserlicht zum Leuchten angeregt werden. Allerdings waren die bisher verwendeten Farbstoffe oft schwer in lebende Zellen einzubringen oder sie töteten das Gewebe rasch ab, sodass sich Vorgänge in der Zelle nicht über einen längeren Zeitraum hinweg beobachten ließen. „Erst vor kurzem hat man neuartige Farbstoffe nutzbar gemacht: fluoreszierende Proteine, die zum Beispiel aus Quallen stammen und mit molekularbiologischen Werkzeugen und der zelleigenen Synthesemaschinerie fast an jedes Eiweiß gekoppelt werden können“ , erklärt Ulrich Simon. Mit ihnen lassen sich Zellbestandteile so markieren, dass die Zelle dabei am Leben bleibt.

Um die Vorgänge in der Zelle möglichst vollständig zu verfolgen, müssen viele Strukturen gleichzeitig abgebildet werden: Man markiert sie dazu mit verschiedenen Farbstoffen. Die Schwierigkeit dabei ist, dass die verfügbaren Varianten von fluoreszierenden Proteinen meist grünlich erscheinen. Die Folge: Während die Forscher mit herkömmlichen mikroskopischen Verfahren durch Farbfilter noch zwei bis drei verschiedene Farben synthetischer Farbstoffe trennen konnten, ist eine saubere Trennung der fluoreszierenden Proteine mit diesen Techniken nicht möglich.

Eine weit bessere Farbauflösung erlaubt das Laser-Scanning-Mikroskop, das ein Forscherteam um Ulrich Simon bei Carl Zeiss entwickelt hat. Mit dem LSM 510 META lassen sich erstmals die feinen Farbnuancen zahlreicher fluoreszierender Proteine unterscheiden. „Wir haben unseren Mikroskopen beigebracht, die verschiedenen grünen Farbstoffe zu trennen, selbst wenn ihre spektralen Eigenschaften fast völlig identisch sind“, sagt Simon.

Das Verfahren basiert auf einem optischen Gitter, das die durch den Laser hervorgerufenen Fluoreszenzsignale in ihre Farbanteile zerlegt. Die Farbkomponenten werden von einem Detektor aufgefangen, der die exakte Farbverteilung des Fluoreszenzlichts für jeden Bildpunkt misst. Ein Computeralgorithmus macht die Beiträge der einzelnen Farbstoffe sichtbar.

Das schafft ganz neue Kombinationsmöglichkeiten von Farbstoffen. Gleichzeitig lassen sich so zurzeit bis zu acht Farbstoffe simultan aus dem Mikroskop-Farbspektrum berechnen und zuordnen. „Die Auswahl der Farbstoffe für ein Experiment kann auf die Anforderungen der lebenden Zelle abgestimmt werden“, sagt Ralf Wolleschensky, Entwicklungsprojektleiter Advanced Imaging Microscopy bei Carl Zeiss Jena. „Das erlaubt Messungen mit einer neuen Qualität und Geschwindigkeit.“

Elektronischer Biochip:

Molekülfang im Minilabor

Sie sind nicht größer als ein Fingernagel, doch sie enthalten ein komplettes kleines Chemielabor: Biochips werden immer beliebter, wenn es darum geht, menschliches Erbgut auf bestimmte Merkmale zu analysieren oder in Lebensmitteln und Trinkwasser nach Giftstoffen und Krankheitserregern zu suchen. Bislang allerdings kommen die Miniaturlabors meist nur in größeren Instituten zum Einsatz, denn der simplen Funktionsweise steht eine aufwendige Methode zum Auslesen der Analyseergebnisse entgegen.

Die Arbeitsweise von Biochips ist dabei stets dieselbe: Auf dem aus Glas oder Keramik gefertigten Chip sind verschiedene Biomoleküle – „Fängermoleküle“ – verankert, die andere Moleküle an sich binden können. Damit lassen sich in einer Lösung – etwa Milch, Blut oder Wasser – gezielt bestimmte biochemische Verbindungen aufspüren, etwa Sequenzen des Erbmoleküls DNA. Das geschieht nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip: Hat man eine Hälfte eines DNA-Doppelstrangs auf dem Siliziumchip angebracht, so kann man die andere Hälfte zielsicher aus einer Mixtur verschiedenster Substanzen herausfischen.

Das Problem bei der Anwendung solcher Biochips ist, dass sie bisher mit einer optischen Nachweismethode arbeiten. Dabei werden Lichtsignale, die durch das Andocken der gesuchten Moleküle hervorgerufen werden, mit Hilfe spezieller optischer Instrumente sichtbar gemacht. Dieses Verfahren ist teuer und aufwendig – und macht die Chips ungeeignet für eine mobile Nutzung, etwa in Krankenhäusern, bei Ärzten oder Feuerwehreinsätzen.

Anders bei einer Nachweistechnik, die Forscher am Fraunhofer-Institut für Siliziumtechnologie (ISIT) in Itzehoe sowie der Unternehmen Siemens und Infineon Technologies entwickelt haben. Damit lassen sich die Treffer beim Aufspüren von Molekülen direkt elektronisch am Biochip auslesen. „Der Chip enthält ultrafeine Gold-Elektroden, auf denen unterschiedliche Fängermoleküle über Schwefel-Atome chemisch angebunden werden“, erklärt Dr. Rainer Hintsche, Abteilungsleiter Biotechnische Mikrosysteme am ISIT. Sobald eine Sorte dieser molekularen Lockvögel ihr passendes Gegenstück gefunden hat, wird ein elektrisches Signal ausgelöst, das ein Messgerät registriert und auswertet. „Durch die direkte elektrische Messung können die Biosensoren kleiner und robuster gemacht werden“, nennt Hintsche den Vorteil der neuen Technologie.

Das Konzept der elektronischen Biochips entstand im Team von Rainer Hintsche am ISIT, wo auch das erste komplette Messsystem demonstriert wurde. Beim Halbleiterhersteller Infineon brachten Mikroelektronik-Spezialisten die „Intelligenz“ mit auf den Biochip, die eine auf ihm integrierte Signalverarbeitung zulässt und mehr als 100 Tests pro Chip gleichzeitig erlaubt. In den Erlanger Entwicklungslabors von Siemens benutzten Ingenieure solche Chips für die Weiterentwicklung und Verkleinerung der Messsysteme.

Die Biochips werden mit etablierten Verfahren der Siliziumtechnologie gefertigt, die auch bei der Produktion von Mikrochips für Computer genutzt werden. Dadurch lassen sich die Biosensoren als Massenprodukt herstellen – und bieten so eine preiswerte Möglichkeit für die medizinische Diagnostik, die schnelle, automatische und zuverlässige Analysen vor Ort in Arztpraxen oder in Katastrophengebieten erlaubt. Daneben können die Biochips für Lebensmittel-Tests, zur Analyse von Arzneimitteln oder für die Suche nach Umweltgiften genutzt werden.

„Bei medizinischen Applikationen geht es unter anderem um die schnelle Diagnose von Infektionskrankheiten“, erklärt Dr. Walter Gumbrecht, bei Siemens Projektleiter für elektrische Lab-on-a-Chip-Systeme. Zudem können Biochips bei der Auswahl der richtigen Dosierung von Arzneimitteln helfen. Bislang dosieren die Ärzte meist allein nach Alter und Gewicht eines Patienten. Wie der Stoffwechsel ein Medikament umsetzt, hängt aber von den individuellen Informationen ab, die in den drei Milliarden Basen der DNA gespeichert sind. „Die Idee ist: Man sucht die entsprechenden Teilstücke aus der DNA heraus, die diesen Stoffwechsel bestimmen, und untersucht mit Hilfe eines Biochips, welche Base bei dem jeweiligen Patienten dort vorhanden ist“, sagt Dr. Roland Thewes, Leiter einer Forschungsabteilung bei Infineon, die die Entwicklungsprojekte zu elektronischen Biosensoren betreibt. „Mit dieser Erkenntnis kann der Arzt eine exakte Dosierung der Medikamente vornehmen sowie Allergien gegen bestimmte Wirkstoffe sofort nachweisen.“

UV-Laserbearbeitung: Sparsam durch Laserlicht

Das Herz eines Motors schlägt in seinen Zylindern. Dort wird die chemische Energie des Kraftstoffs in mechanische Leistung für den Antrieb umgewandelt. Und dort wird maßgeblich darüber bestimmt, wie sauber die Abgase sind und wie rasch der Motor verschleißt. Bei hohem Ölverbrauch führt das zu einem hohen Anteil unverbrannter Kohlenwasserstoffe im Abgas. Gleichzeitig beschleunigt die Rußbildung bei Dieselmotoren die Abnutzung von Zylindern und Kolben.

Ziel der Motorkonstrukteure ist es daher, die Zylinder so zu bauen, dass der Bedarf an Schmieröl möglichst gering ist. Daneben gilt ihr Augenmerk dem Kraftstoffverbrauch des Fahrzeugs. Um ihn zu senken, ist ein höherer Verbrennungsdruck im Motor erforderlich. Der wiederum führt zu einer stärkeren mechanischen Belastung der inneren Oberfläche der Zylinder – der „ Zylinderlaufbahn“ – und der daran entlang gleitenden Kolbenringe.

Die Zylinderlaufbahn so zu gestalten, dass sie die höheren mechanischen Anforderungen bei gleichzeitig niedrigerem Ölverbrauch erfüllt, ist mit der bislang üblichen mechanischen Bearbeitungstechnik kaum zu erreichen. Beim so genannten Honen bewegt sich ein mit Schleifkörpern besetztes Werkzeug im Zylinder auf und ab, während es gleichzeitig um seine eigene Achse rotiert. Der Nachteil dieses Verfahrens: „Diamantsplitter in den Schleifkörpern bewirken, dass das Werkzeug weniger schneidet als reißt“, sagt Horst Joachim Lindner, Fachreferent Produkt- und Fertigungsverfahrenstechnik bei Audi in Ingolstadt. Durch die spezielle Bewegung des Werkzeugs entsteht auf der Zylinderlaufbahn eine Riefenstruktur, in der sich relativ viel Öl ansammelt.

Gleitet der Kolbenring beim Betrieb des Motors auf der Zylinderlaufbahn, so wird er sehr stark mit Öl benetzt. Die Folge ist ein unnötig hoher Ölverbrauch. „Das Öl hat eine isolierende Wirkung“ erläutert Lindner. „Je dicker der Ölfilm ist, desto höher wird die Temperatur auf der Zylinderwand. Dadurch verdampft mehr Öl und gelangt in Form unverbrannter Kohlenwasserstoffe ins Abgas.“

Dabei zeichnet sich der Grauguss, aus dem der Zylinder gefertigt wird, eigentlich durch eine Eigenschaft aus, die für sparsames Schmieren ideal ist: Er enthält feine Lamellen aus Graphit, in denen sich wohldosierte Mengen von Öl sammeln könnten. Beim Honen jedoch verschiebt das Werkzeug das Material an der Oberfläche des Zylinders, sodass diese Lamellen auf brachiale Weise zugeschmiert werden.

Zusammen mit Wissenschaftlern vom Lehrstuhl für Werkstoffwissenschaften der Universität Erlangen-Nürnberg sowie Bayreuth haben die Audi-Ingenieure nun ein Verfahren entwickelt, das es ermöglicht, die natürliche Lamellenstruktur des Materials zur Ölhaltung zu nutzen. Der Trick dabei: Ein Laser, der energiereiche Lichtpulse aussendet, ersetzt teilweise das mechanische Werkzeug bei der Zylinderbearbeitung.

Bei der UV-Laserbelichtung wird die Zylinderlaufbahn zunächst durch konventionelles Honen vorbearbeitet. Anschließend tragen die ultravioletten Lichtblitze eines Excimer-Lasers das dabei verschobene Material ab und legen die Lamellen darunter frei. Ein weiterer erwünschter Effekt: Das Material an der Oberfläche des Zylinders schmilzt durch das intensive Laserlicht etwa einen Mikrometer tief auf. Als Folge entsteht ein Plasma – ein Metalldampf mit hohem Energiegehalt, der molekularen Stickstoff aus der Luft in reaktiven atomaren Stickstoff verwandelt und ihn in die geschmolzene Oberflächenschicht treibt. Das Material erstarrt dabei zu einer nanokristallinen Struktur. Der hohe Stickstoff-Gehalt verleiht diesem Gefüge keramische Eigenschaften – und damit eine hohe Verschleißfestigkeit und Korrosionsbeständigkeit.

Ein zusätzlicher Beitrag zum Verschleißschutz: Wenn der Motor läuft, verwandelt sich das nanokristalline Material durch Verbrennungs- und Reibungswärme in eine extrem feine Struktur aus Eisenkörnchen mit eingelagertem Kohlenstoff und Stickstoff, die superplastische Eigenschaften hat: Sie ist extrem nachgiebig, was eine Abnutzung der Oberfläche erschwert.

Die hohe Verschleißfestigkeit der Zylinder erhöht die Lebensdauer des Motors. Zudem resultieren aus der geringeren Reibung zwischen Kolben und Zylinder einige PS mehr an Leistung. Die spezielle Struktur der laserbearbeiteten Zylinderoberfläche hingegen verringert den Ölverbrauch drastisch – „je nach Betriebszustand des Motors um durchschnittlich 50 bis zu 75 Prozent“, sagt Lindner. Das wiederum führt zu deutlich besseren Abgaswerten. Den seit Januar 2004 in Serie gebauten 3-Liter-V6-TDI-Motor fertigt Audi erstmals mit dieser Technologie.

anticaline: Krebskiller „light“

„Seit etwa 20 Jahren zeichnet sich in der Entwicklung von Arzneimitteln ein neuer Trend ab“, sagt Arne Skerra. Damit meint der Professor für Biologische Chemie der Technischen Universität München den Trend weg von synthetischen Substanzen hin zu Proteinen – großen biochemischen Molekülen, die auch vom Körper selbst gebildet werden. „Man hat erkannt, dass die Proteine eine stärker zielgerichtete Wirkung mit sich bringen“, erklärt Skerra. Ein Beispiel dafür ist die Krebstherapie. Besonders im Blickfeld der Pharmakologen sind dort Antikörper – eine Klasse von Proteinen, die das menschliche Immunsystem normalerweise erzeugt, um körperfremde Substanzen unschädlich zu machen. Mit gentechnisch hergestellten Antikörpern lässt sich Tumorgewebe sehr viel spezifischer und effektiver angreifen als mit den bislang verwendeten niedermolekularen Wirkstoffen.

Als Beispiel nennt Skerra die Chemotherapie: „Dort werden Substanzen angewandt, die nur eine geringe Spezifität haben.“ Das heißt: Sie attackieren nicht nur die Tumorzellen, sondern auch andere Teile des Körpers. Die Folge sind Nebenwirkungen wie starke Übelkeit und Haarausfall.

Inzwischen hat man gelernt, dass geeignete Antikörper eine vergleichbare heilende Wirkung bei deutlich weniger Nebenwirkungen erzielen können. „Das Problem besteht darin, dass der Körper, wenn er krank ist, offenbar die richtigen Antikörper nicht immer rechtzeitig bilden kann“, sagt der Münchner Wissenschaftler. Daher wollen Biochemiker dem Immunsystem auf die Sprünge helfen – mit Biomolekülen, durch so genanntes Proteindesign im Labor: Die Forscher versuchen, maßgeschneiderte Proteine zu gewinnen, die als Arzneimittel im Körper genau die Funktion übernehmen, die nötig ist, um zum Beispiel einen Angriff auf Krebszellen auszuführen. Erste Medikamente, die auf Antikörpern basieren, wurden bereits vor einigen Jahren zugelassen.

Allerdings: Die Antikörper haben für die medizinische Anwendung auch Nachteile. Einer ist ihre aufwendige Produktion. „ Die Antikörper müssen in Zellkultur-Bioreaktoren hergestellt werden, für die es weltweit nur beschränkte Produktionskapazitäten gibt“, erklärt Arne Skerra. Das macht die Wirkstoffe sehr teuer. Ein anderes Manko ist die Struktur der Biomoleküle: Antikörper sind besonders große Proteine. Sie können deshalb nur schlecht Zwischenräume zwischen Zellen durchdringen – was es ihnen beispielsweise erschwert, in einen Tumor zu gelangen.

Die Forscher im Team von Arne Skerra haben nun eine Alternative entwickelt: die Anticaline – so etwas wie eine miniaturisierte Version der effektiven, aber sperrigen Biomoleküle. „Anticaline sind viel kleiner und besitzen einen einfacheren Aufbau als Antikörper“, erläutert Skerra. „Doch trotz der Unterschiede sind die funktionellen Eigenschaften denen der Antikörper ähnlich.“ Das bedeutet: Auch die Anticaline können biologische Strukturen im Körper erkennen und Zellen gezielt beeinflussen oder sogar zerstören.

„Die Innovation besteht darin, dass wir das Wirkprinzip von Antikörpern auf ein anderes Protein-Strukturgerüst übertragen haben“, sagt Arne Skerra – und zwar mit den Methoden des Proteindesigns. Als Ausgangspunkt dienen dabei Lipocalin-Proteine. Das sind im Prinzip körpereigene Eiweiße, die ähnlich wie Antikörper spezifische Bindungseigenschaften für andere Biomoleküle aufweisen, aber im Gegensatz zu diesen vom Immunsystem nicht verwendet werden. Um sie so zu verändern, dass sie die für einen bestimmten Einsatzzweck gewünschten Eigenschaften erhalten, nutzen die Wissenschaftler die Gentechnik: Bakterien werden so umprogrammiert, dass sie nach einem in ihre Erbsubstanz (DNA) eingefügten Bauplan das gewünschte Protein produzieren. Danach werden die Bakterien abgetötet und aus ihnen das Protein gewonnen.

Inzwischen haben Skerra und Mitarbeiter ein Unternehmen, die Pieris Proteolab AG, aus der TU München ausgegründet, um Medikamente auf der Basis von Anticalinen bis zur Marktreife zu entwickeln – etwa Arzneimittel, um Herz-Kreislauf- oder Krebserkrankungen zu behandeln. Mit dem Start erster klinischer Versuche rechnet Skerra innerhalb der nächsten zwei bis drei Jahre. ■

Ralf Butscher