Leuchtende Forschungshelfer

Komplizierte Biochemie

Als der Biochemiker Osamu Shimomura GFP 1961 erstmalig aus den Quallen isolierte, hatte er nicht die leiseste Ahnung, als welch nützliches Werkzeug es sich entpuppen würde. Die Entdeckung des GFPs ist überhaupt ein lehrreiches Stück Wissenschaftsgeschichte, das wieder einmal zeigt, dass Ausdauer und die Kreativität mehrerer Köpfe nötig sind, um das Rad der Erkenntnis weiterzudrehen. Aber es offenbart auch, wie knapp man als Forscher Ruhm und Ehre verfehlen kann.

Shimomura zieht 1960 von Japan an die US-amerikanische Ostküste, wo er an der Princeton University das Leuchtphänomen von Aequora victoria erforschen will. Im Sommer 1961 quert er zum ersten Mal die USA, um in Friday Harbor gemeinsam mit seiner Familie und Kollegen Tausende schimmernde Quallen aus dem klaren Wasser des Nordostpazifiks zu fischen. Ein Unterfangen, das er jahrelang wiederholen wird. Damals ist es wissenschaftlicher Konsens, dass das Leuchten allein durch die Reaktion der Substanz Luciferin mithilfe des Enzyms Luciferase entsteht. Den Forschenden will es jedoch partout nicht gelingen, Luciferin aus Aequora zu isolieren. Stattdessen isoliert Shimomura ein Protein, das bei Zugabe von Kalziumionen blaues Licht ausstrahlt und das er auf den Namen Aequorin tauft. Aus rund 10.000 Quallen erhält er fünf Milligramm Protein und, als Nebenprodukt in einer noch deutlich geringeren Konzentration, ein grün fluoreszierendes Protein.

Die Leuchtchemie der Qualle erweist sich als kompliziert. Shimomura konzentriert sich zunächst auf Aequorin, das als Kalzium-Indikator Eingang in die Forschung findet und mit dem erstmals nachgewiesen wird, dass Kalzium bei einer Muskelkontraktion freigesetzt wird. Erst 1972 kann Shimomura die chemische Struktur des Aequorin-Chromophors, also die farbgebende Verbindung, nachweisen: Coelenterazin. Die Ausbeute an GFP jedoch ist so gering, dass Shimomura das Protein über mehrere Jahre ansammeln muss, bevor er 1979 auch das ungewöhnliche Chromophor von GFP identifiziert: drei Aminosäuren im Zentrum des Proteins.

Das Farbenspiel von Aequora victoria beruht somit auf einem zweistufigen Prozess: Aequorin erzeugt blaues Licht, dessen Energie auf GFP übertragen wird und es so dazu anregt, energieärmeres grünes Licht auszustrahlen.

Weltweiter Boom

Der Biochemiker Douglas Prasher erkennt als Erster das Potenzial von GFP. Er hält es – entgegen dem Konsens – für möglich, dass GFP bei entsprechendem Lichteinfall auch ohne quallenspezifische Enzyme leuchtet. Prasher hatte 1985 schon das Gen für Aequorin isoliert, in Bakterien kloniert und damit das Leben von Forschern und Quallen erleichtert. Nach mehreren Jahren gelingt es ihm, auch das GFP-Gen zu isolieren. Doch es leuchtet in den Bakterien nicht – was die vorherrschende Hypothese zu bestätigen scheint.

Als die Biologen Martin Chalfie und Robert Tsien den Biochemiker unabhängig voneinander um das GFP-Gen bitten, teilt Prasher die Gen-Sequenz bereitwillig, da eine weitere Finanzierung seines Projekts abgelehnt worden ist. Chalfie und seinem Team gelingt es schließlich, GFP in Bakterien und später auch im durchsichtigen Fadenwurm Caenorhabditis elegans grün leuchten zu lassen, und zwar ohne zusätzliche quallenspezifische Enzyme oder andere Kofaktoren. 1994 schafft es der grün leuchtende Wurm aus Chalfies Labor auf die Titelseite von Science, erregt weltweit Aufmerksamkeit und löst einen GFP-Boom aus.

„Als Prasher das GFP-Gen isoliert und kopiert hatte, hatte er 25 zusätzliche Basenpaare vor dem Gen und 227 nach dem Gen kopiert, was einfacher war, als nur das Gen selbst zu isolieren. Das war damals gängige Praxis, und er glaubte nicht, dass es einen Unterschied machen würde“, berichtet Zimmer in seinem Buch. Die zusätzlichen Bausteine störten aber die korrekte Faltung von GFP, sodass es nicht leuchtete. Chalfies Team hingegen kopierte mit der damals jungen Methode der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) nur das Gen. So wird der Nobelpreis für Chemie 2008 Osamu Shimomura, Martin Chalfie und Roger Tsien verliehen – Prasher geht leer aus.

Tsiens Verdienst war die Weiterentwicklung und Verbesserung von GFP. Mithilfe der sogenannten gerichteten Evolution, bei der die natürlichen Prozesse der Evolution, Mutation und Selektion, im Labor beschleunigt nachgeahmt werden, versuchte er, optische und biochemische Eigenschaften wie Wellenlängenbereich und Faltungsgeschwindigkeit zu verbessern. Dazu veranlassten Tsien und sein Team Mutationen, also kleine DNA-Veränderungen, in der GFP-Gensequenz und wählten dann jene GFP-Proteine aus, die verbesserte Eigenschaften aufwiesen. Auf diese Weise stellten sie 1994 das sogenannte enhanced GFP (EGFP) her, also das „verbesserte“ GFP. Aufgrund einer einzelnen Punktmutation leuchtet das EGFP intensiver und bleicht weniger schnell aus als die ursprüngliche GFP-Version. Bis heute ist es eines der am häufigsten verwendeten fluoreszierenden Proteine. Auf die gleiche Weise entstanden blaue und gelbe Varianten des GFP.

„Studierende und Doktoranden wissen den Nutzen fluoreszierender Proteine heute nicht richtig zu schätzen, weil es für sie völlig selbstverständlich ist, jede Struktur in einer lebenden Zelle markieren zu können“, erzählt Oliver Griesbeck vom Max-Planck-Institut für biologische Intelligenz in Martinsried, der sich noch an die Zeit vor GFP erinnert. Auch die Anzahl verwendbarer Proteine ist massiv gestiegen. „Es sind Hunderte und sie sind in allen Farbabstufungen erhältlich“, sagt Griesbeck, „und es werden immer noch neue gefunden.“ So entdeckten Forscher erst kürzlich weitere fluoreszierende Proteine in verschiedenen Quallen, Ruderfußkrebsen und Aalen.

Ihren Erfolg verdanken fluoreszierende Proteine aus der GFP-Familie ihrem einzigartigen, hochkonservierten Aufbau: Die Proteine bestehen aus 220 bis 240 Aminosäuren, die eine zylinderförmige Struktur ausbilden. Im Zentrum des Zylinders liegen, gut geschützt und nah beieinander, die für die Fluoreszenz entscheidenden drei Aminosäuren, das Chromophor. Ihre stabile Struktur bildet sich spontan in der Zelle, sie brauchen also weder Kofaktoren noch Enzyme und sind somit vollständig genetisch codiert. „Das ist das Tolle an GFPs“, so Griesbeck.

So kann man GFP durch gerichtete Evolution nicht nur neue Eigenschaften „beibringen“, sondern ihre Gensequenz lässt sich mithilfe gentechnischer Methoden gezielt auch in das Erbgut beliebter Modellorganismen wie Bakterien, Fadenwurm, Fruchtfliege oder Maus einfügen. Die transgenen Tiere beziehungsweise deren Zellen stellen die FP selbstständig her, und zwar am gewünschten Ort und in der Regel, ohne den Organismus zu stören.

„Es dauert allerdings Jahre, bis solche Proteine im Labor eingesetzt werden können“, erklärt Griesbeck, der selbst fluoreszierende Proteine für die Hirnforschung optimiert. So funktionieren Proteine, die in Meeresorganismen vorkommen, üblicherweise bei einer Umgebungstemperatur von 15 bis 20 Grad Celsius. Um aber Zellabläufe in Mäusen zu erhellen, müssen die Proteine bei 37 Grad Celsius ihre korrekte dreidimensionale Struktur ausbilden können. Dazu ist Geduld vonnöten, denn es müssen Mutationen in vielen Zehntausend Genkopien erzeugt und die Proteine anschließend auf ihre Eigenschaften getestet werden.

Auch die Ende der 1990er-Jahre entdeckten, rot fluoreszierenden Proteine aus Korallen mussten zunächst optimiert werden. „Sie haben die Tendenz sich zusammenzulagern – doch das will man überhaupt nicht. Das heißt, man muss sie so verändern, dass sie als einzelnes Protein arbeiten“, so Griesbeck. Grundsätzlich waren die roten FP eine willkommene Ergänzung, denn Rot ist besonders gut sichtbar und das Anregungslicht im roten Bereich energieärmer und damit weniger aggressiv für lebende Zellen und Organismen.

Bis heute setzen Forschende fluoreszierende Proteine als Marker ein, um damit die Aktivität von Genen zu untersuchen, Proteinbewegungen in der Zelle zu verfolgen oder auch ganze Zellen zu visualisieren. Die Entwicklung unterschiedlich farbiger FP ermöglicht etwa die gleichzeitige Beobachtung mehrerer Zellen. Ein ästhetisch besonders gelungenes Experiment hatte 2007 Erfolg, als Neurowissenschaftler die Nervenzellen in Mäusehirnen in über 90 Farbtönen erstrahlen ließen. „Brainbow“ nannten die Wissenschaftler ihr Verfahren, zusammengesetzt aus den englischen Wörtern für Gehirn und Regenbogen. Mithilfe der Technik ließ sich verfolgen, wie Neuronen wachsen, wie sie sich verbinden und verzweigen und wie sie Netzwerke bilden. Brainbow wurde seither weiterentwickelt und beispielsweise zur Erforschung der Gehirne von Zebrafischen und Fliegen eingesetzt.

Vielfältige Anwendung

„Die Bandbreite der Anwendungen von fluoreszierenden Proteinen übersteigt die Vorstellungskraft“, schrieb Osamu Shimomura in seiner Kurzbiografie anlässlich der Nobelpreis-Verleihung 2008. Diese Bandbreite sorgt dafür, dass kein fluoreszierendes Protein für alle Anwendungen geeignet ist: „Die Proteine der GFP-Familie haben alle eine ähnliche Größe, und für manche Experimente sind sie einfach zu groß“, sagt Karl-Erich Jaeger, Direktor des Instituts für Molekulare Enzymtechnologie der Universität Düsseldorf am Forschungszentrum Jülich. GFP sind für die Reifung ihres Chromophors außerdem auf Sauerstoff angewiesen und somit nur in aeroben Systemen anwendbar, etwa in Wirbeltier- oder Insektenzellen, nicht aber in anaeroben Systemen, zum Beispiel bestimmten Darmbakterien.

Die Arbeitsgruppe von Jaeger war an der Entwicklung einer neuen Gruppe von Fluoreszenzproteinen aus Bakterien beteiligt, die den Kofaktor Flavinmononucleotid (FMN) als Chromophor binden und deshalb als FMN-bindende Fluoreszenzproteine (FbFP) bezeichnet werden. FbFP sind klein und leuchten im Gegensatz zu GFP auch unter anaeroben Bedingungen. Der Chromophor FMN kommt sowohl in Bakterien und in Pflanzen als auch in menschlichen Zellen vor, die FbFP leuchten aber weniger hell als die GFP. FbFP werden in der Grundlagenforschung ebenso wie in der Biotechnologie verwendet, etwa als fluoreszierende Marker für anaerobe probiotisch wirksame Bakterien im Verdauungstrakt oder für anaerobe pathogene Bakterien und Pilze.

Neben FP verwendet man in den Biowissenschaften verschiedene fluoreszierende Farbstoffe, die noch viel kleiner sind. Im Vergleich zu fluoreszierenden Proteinen sind sie meist heller und bleichen nicht so schnell aus. Für den Einsatz in der Forschung sind inzwischen Hunderte von ihnen in allen erdenklichen Farben erhältlich. Im Vergleich zu FP haben sie aber zwei Nachteile: Da sie nicht genetisch codiert sind, kann die Zelle sie nicht selbst herstellen. Sie müssen daher, falls Strukturen im Inneren einer Zelle sichtbar gemacht werden sollen, von außen in die Zelle eingeschleust werden, was nicht alle Zelltypen tolerieren. In der Zelle angekommen, „wissen“ sie außerdem nicht, welche Struktur sie markieren sollen, müssen also zuvor an Antikörper oder in der Zelle an Proteinfragmente gekoppelt werden, die die gewünschten Strukturen sicher erkennen. So müssen für jedes Experiment die Vor- und Nachteile der Farbgebung abgewogen werden.

Neue Mikroskope

Die Weiterentwicklung fluoreszierender Proteine und Farbstoffe geht Hand in Hand mit den bahnbrechenden Fortschritten in der Mikroskopie, heute treffender als Nanoskopie bezeichnet. „Das ist momentan ein Kick in der Wissenschaft“, sagt Jaeger. Vor rund 20 Jahren hat die sogenannte STED-Mikroskopie (STED = Stimulated Emission Depletion) das Auflösungsvermögen der klassischen Lichtmikroskopie, das bei 200 Nanometer (Millionstel Millimeter) liegt, um eine Zehnerpotenz gesteigert, man erreicht also eine Trennschärfe von bis zu 20 Nanometern. Für die Entwicklung der STED-Methode erhielt Stefan Hell vom Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie in Göttingen 2014 den Chemie-Nobelpreis. Mit den sogenannten MINFLUX- und MINSTED-Nanoskopie-Techniken haben Hell und sein Team das Auflösungsvermögen jüngst um eine weitere Zehnerpotenz gesteigert: Den Forschern ist es gelungen, einzelne fluoreszierende Moleküle in Zellen darzustellen, mehrfarbig und in 3D und 100 Mal schärfer als mit einem herkömmlichen Lichtmikroskop.

Franziska Theilig, Direktorin des Anatomischen Instituts in Kiel, nutzt eines der wenigen bislang in Deutschland eingesetzten STED-Mikroskope. Das hochauflösende Fluoreszenzmikroskop liefert extrem scharfe Bilder von ultrafeinen Strukturen, die etwa 2000 Mal kleiner sind als der Durchmesser eines menschlichen Haars. Auf diese Weise lässt sich das Innere von Zellen, aber vor allem auch Gewebe noch genauer untersuchen. „Gewebe kommt der Wirklichkeit im Organismus näher, aber im Gewebe sind die Zellen alle viel dichter gepackt, weswegen es viel schwieriger ist, feine Elemente voneinander zu unterscheiden als in einer einzelnen Zelle“, erklärt Theilig.

Durch den Vergleich von gesundem und krankem Gewebe mithilfe des STED-Mikroskops lässt sich etwa erkennen, ob es zu Veränderungen bestimmter Proteine kommt oder ob diese gehäuft vorliegen, was wiederum Rückschlüsse auf die Entstehung oder den Verlauf einer Erkrankung zulässt. Diese Erkenntnisse können in der Diagnostik und Therapie von Nutzen sein.

Bei medizinischen Anwendungen am Menschen werden ebenfalls Fortschritte erzielt. Bislang sind allerdings nur wenige Fluoreszenzfarbstoffe im Einsatz, da ihre Entwicklung und Zulassung als medizinisches Kontrastmittel zwei- bis dreistellige Millionenbeträge erfordert. Fluoreszenzproteine scheiden von vorneherein aus, da sie einen gentechnischen Eingriff voraussetzen, der sich an Menschen verbietet.

Ein internationales Team des Helmholtz Zentrums München und des Nationalen Centrums für Tumorerkrankungen (NCT) am Universitätsklinikum Dresden arbeitet bereits an einer Bildgebungsmethode, die die Krebschirurgie verbessern könnte. Mit Fluoreszenzfarbstoffen werden unterschiedliche Gewebe spezifisch angefärbt: etwa Tumorzellen rot, Nerven grün, Blutgefäße blau. Dazu koppeln die Wissenschaftler Fluoreszenzfarbstoffe an Antikörper, die zellspezifische Oberflächenmerkmale erkennen. „Noch ist die Methode nicht praxistauglich“, sagt Oliver Bruns vom NCT, „aber wir hoffen, die Selektivität verbessern zu können.“ Zukünftig könnte Gewebe anhand der verschiedenen Merkmale von Zelltypen farblich sauber getrennt werden. Auf diese Weise ließe sich ein Tumor millimetergenau verorten und mitsamt möglicher Metastasen entfernen, das umliegende Gewebe würde hierbei geschont. Die erhaltene Bildinformation soll zudem als Video abspielbar sein.

Langfristig hält Jaeger selbst die Entwicklung eines „molekularen Fernsehers“ für möglich. Mithilfe von FP und entsprechenden Nanoskopietechniken könnte man Zellen dann in Echtzeit dabei zuschauen, wie sie Proteine herstellen.